Sådan fremstilles Glycerol Stock: 9 trin (med billeder)

Indholdsfortegnelse:

Sådan fremstilles Glycerol Stock: 9 trin (med billeder)
Sådan fremstilles Glycerol Stock: 9 trin (med billeder)

Video: Sådan fremstilles Glycerol Stock: 9 trin (med billeder)

Video: Sådan fremstilles Glycerol Stock: 9 trin (med billeder)
Video: How to Create a Title Page in MLA 9th Style 2024, Marts
Anonim

Glycerolstamme er en type suspension, der bruges i laboratorieindstillinger til opbevaring af bakteriekulturer i længere tid. Når flydende bakteriekulturer tilsættes til en 50% glycerolopløsning, infunderer glycerolen i bakteriecellerne, hvilket gør dem strukturelt stabile og gør det muligt at opbevare dem sikkert. Efter blanding af dine prøver skal du fryse dem ved -80 ° C (−112 ° F) for at sikre, at de forbliver levedygtige så længe som muligt.

Trin

Del 1 af 3: Blanding af glycerolopløsningen

Forbered Glycerol Stock Trin 1
Forbered Glycerol Stock Trin 1

Trin 1. Forbered en flydende kultur af de bakterier, du vil opbevare

For at en glycerolbestanddel skal være effektiv, skal den kombineres med en flydende bakteriekultur. At producere en flydende kultur vil kræve, at du inkuberer en bakterieprøve natten over i en Erlenmeyer -kolbe fyldt med lysogen bouillon og den korrekte koncentration af antibiotika.

  • Når du har forberedt en flydende kultur, kan du lægge bakterierne i opbevaring eller fortsætte med at isolere plasmid -DNA'et.
  • Lysogen bouillon (også kendt som "LB bouillon" og "LB væske") er en type næringsrig væske, der bruges til hurtigt at sprede bakterier. Det kan købes hos en forhandler, der sælger laboratorieudstyr og materialer.
  • Inkubation af bakteriekulturer er en yderst teknisk proces, der involverer mange forskellige variabler. Af denne grund udføres den bedst af en uddannet tekniker i et kontrolleret laboratorium.
Forbered Glycerol Stock Trin 2
Forbered Glycerol Stock Trin 2

Trin 2. Fortynd ren glycerol i destilleret vand for at skabe en 50% glycerolopløsning

Brug en steril pipette til at måle 10 ml af begge væsker og kombinere dem i en enkelt kolbe. Rør eller ryst kolben grundigt, indtil væskerne er jævnt blandet.

  • Fortynding af glycerolen er nødvendig for at forhindre, at den beskadiger bakteriecellerne.
  • Nogle forskere foretrækker at bruge en glycerolopløsning så lav som 15-40% for at undgå at kompromittere bakteriekulturen. En 50% blanding giver dog maksimal levetid ved opbevaring.
Forbered Glycerol Stock Trin 3
Forbered Glycerol Stock Trin 3

Trin 3. Overfør 50 mikroliter af 50% glycerolopløsningen til et mikrofugerør

Flyt det fortyndede glycerol forsigtigt til det nye hætteglas for at undgå spild. Du vil bruge den samme beholder til at tilføre glycerolopløsningen den flydende bakteriekultur og placere prøven i kølerum.

Hvis det er muligt, skal du bruge et rør med en skruetop frem for et med en snap -top. Snap top -rør har været kendt for at åbne ved et uheld ved blanding og langvarig opbevaring

Del 2 af 3: Tilføjelse af bakteriekulturen

Forbered Glycerol Stock Trin 4
Forbered Glycerol Stock Trin 4

Trin 1. Tilsæt 50 mikroliter af din flydende bakteriekultur til opløsningen

Brug en frisk pipette til at måle en lige stor mængde af den flydende kultur og hæld den direkte i glycerolopløsningen i røret. De endelige andele af din glycerolbeholder skal være 50% bakterier og 50% fortyndet glycerol.

  • Brug af uforholdsmæssige mængder glycerol og flydende kultur kan påvirke bakteriernes hårdhed og reducere den tid, den kan overleve i kølerum.
  • Hvis du bruger en glycerolopløsning med en lavere koncentration, skal du justere mængden af bakteriekultur i overensstemmelse hermed. Se litteraturen om den nøjagtige stamme, du gemmer, for at få flere oplysninger.
Forbered Glycerol Stock Trin 5
Forbered Glycerol Stock Trin 5

Trin 2. Læg låget på røret

Skru låget på plads, eller tryk det ned, indtil du hører et blødt klik, hvis du bruger et snap -top -rør. Kontroller, at låget er fastgjort, før du går videre.

Forbered Glycerol Stock Trin 6
Forbered Glycerol Stock Trin 6

Trin 3. Ryst røret forsigtigt for at blande bakteriekulturen og glycerol

Pisk røret frem og tilbage et par gange, indtil begge væsker er jævnt fordelt. På dette tidspunkt vil bakteriecellerne langsomt begynde at absorbere glycerolopløsningen, som vil stabilisere og beskytte cellemembranen mod forringelse og temperaturrelateret skade.

Hold tommelfingeren trykket fast mod låget på mikrofugerøret, mens du ryster for at sikre, at det ikke løsner

Del 3 af 3: Opbevaring og genoplivning af bakteriekulturer

Forbered Glycerol Stock Trin 7
Forbered Glycerol Stock Trin 7

Trin 1. Mærk bakterieprøven

Skriv navnet på kulturen på en lille reagensglasetiket eller en stribe malertape, og klæb det til mikrofugerøret, hvor det vil være tydeligt synligt. Du kan også skrive bakteriens klassificeringsoplysninger direkte på låget ved hjælp af en filt-markeret markør.

  • Sørg også for at registrere andre oplysninger, der kan vise sig nyttige under analysen, f.eks. Den nøjagtige stamme af prøven eller dens oprindelse.
  • Mærkning af dine prøvebeholdere er et uundværligt trin i indsamlingsprocessen, da det giver dig mulighed for at holde styr på deres indhold, når de blandes rundt i og uden for opbevaring.
Forbered Glycerol Stock Trin 8
Forbered Glycerol Stock Trin 8

Trin 2. Frys prøven ved -80 ° C (-112 ° F)

Placer den mærkede prøve i en afkølet laboratoriefryser indstillet til en konstant temperatur på -80 ° C (-112 ° F). Når den holdes under disse betingelser, vil bakteriekulturen forblive levedygtig i flere år.

Det er kritisk, at temperaturen i fryseren forbliver fast på -80 ° C (-112 ° F). Hvis det er varmere, kan de bevarede bakterier dø

Forbered Glycerol -lager Trin 9
Forbered Glycerol -lager Trin 9

Trin 3. Skrab en lille mængde frosne bakterier op for at forberede den til analyse

Når det er tid til at genoplive din prøve, skal du fjerne mikrofugerøret fra fryseren og åbne låget. Brug en steril podningssløjfe, tandstikker eller pipettespids til at opsamle en lille mængde frosset materiale fra toppen af prøven og stribe bakterierne på en LB -agarplade til undersøgelse eller test.

  • Pas på ikke at lade bakterierne skrabe. Det kan hjælpe at holde tømmerøret på tøris, indtil du har gennemført dine test.
  • Træk kun din prøve ud af fryseren, når det er absolut nødvendigt. Gentagen optøning og genfrysning reducerer levetiden betydeligt.

Anbefalede: