Sådan Gram -farvning (med billeder)

Indholdsfortegnelse:

Sådan Gram -farvning (med billeder)
Sådan Gram -farvning (med billeder)

Video: Sådan Gram -farvning (med billeder)

Video: Sådan Gram -farvning (med billeder)
Video: 5 tips der giver dig topkarakter - Hack dig til et 12-tal (1:3) 2024, Marts
Anonim

Gramfarvning er en hurtig procedure, der bruges til at lede efter tilstedeværelsen af bakterier i vævsprøver og til at karakterisere bakterier som gram-positive eller gram-negative, baseret på de kemiske og fysiske egenskaber af deres cellevægge. Gram -pletten skal næsten altid udføres som det første trin i diagnosen af en bakterieinfektion.

Gram -pletten er opkaldt efter den danske videnskabsmand Hans Christian Gram (1853 - 1938), der udviklede teknikken i 1882 og udgav den i 1884 som en teknik til at skelne mellem to typer bakterier med lignende kliniske symptomer: Streptococcus pneumoniae (også kendt som pneumococcus) og Klebsiella pneumoniae bakterier.

Trin

Del 1 af 3: Forberedelse af en gramfarvning

Gramfarvning trin 1
Gramfarvning trin 1

Trin 1. Forbered dig på laboratoriearbejde

Tag handsker på, og bind langt hår tilbage for at forhindre kontaminering af den bakterieprøve, du vil teste. Desinficer et arbejdsområde under stinkskaben eller i et andet godt ventileret område. Kontroller, at bunsenbrænder og mikroskop er funktionelle, før du begynder.

Gramfarvning Trin 2
Gramfarvning Trin 2

Trin 2. Steriliser et glasmikroskopglas

Hvis glasset er snavset, vask det i sæbevand for at fjerne fedt og snavs. Desinficer objektglasset med ethanol, glasrens, eller hvilken metode der anbefales af dit laboratorium.

Gramfarvning trin 3
Gramfarvning trin 3

Trin 3. Tilføj prøven til diaset

Du kan bruge Gram -farvemetoden til at hjælpe med at identificere bakterier, der findes i medicinske prøver eller bakteriekulturer dyrket i en petriskål. For at Gram -pletten kan være nyttig, tilføj en tynd lag af prøven på pletten. En prøve under 24 timer gammel anbefales, da ældre bakterier kan have beskadiget cellevægge, der reagerer mindre forudsigeligt på gramfarvning.

  • Hvis du bruger en vævsprøve, skal du tilføje 1-2 dråber på glasset. Fordel det jævnt på objektglasset for at danne et tyndt udstrygning ved hjælp af kanten af et andet steriliseret glasglas. Lad det lufttørre, inden du fortsætter.
  • Hvis du tager bakterier fra en petriskål, skal du sterilisere en inokulationssløjfe i en Bunsen -brænderflamme, indtil den lyser, og lad den afkøle. Brug den til at placere en dråbe sterilt vand på objektglasset, steriliser derefter og afkøl sløjfen igen, før du overfører en lille prøve af bakterier og forsigtigt omrører i vandet.
  • Bakterier i bouillon skal blandes i en vortexer, derefter tilsættes med en inokulationssløjfe som ovenfor uden at tilføje det ekstra vand.
  • Hvis du har en vatpindprøve, skal du rulle podepinden let hen over diaset.
Gramfarvning trin 4
Gramfarvning trin 4

Trin 4. Varmefiks udstrygningen

Varme fikserer bakterierne til objektglasset, så de ikke lige så let skylles af under pletten. Før hurtigt diaset to til tre gange gennem en Bunsen -brænderflamme, eller varm det oven på en elektrisk glidevarmer. Overophed ikke, da prøverne kan blive forvrængede. Hvis du bruger en Bunsen -brænder, bør flammen være en lille, blå kegle, ikke en høj orange.

Alternativt kan udstrygningen fikseres med methanol i stedet ved at tilsætte 1-2 dråber methanol på det tørrede udstrygning, dræne det overskydende methanol af og lade det lufttørre. Denne metode minimerer skader på værtsceller, hvilket giver en renere baggrund

Gramfarvning trin 5
Gramfarvning trin 5

Trin 5. Placer objektglasset på en farvningsbakke

En farvningsbakke er et lavt fad af metal, glas eller plast med et lille net eller trådstøtte, der løber hen over toppen. Placer objektglasset oven på denne støtte, så de væsker, du bruger, kan løbe ned i bakken.

Hvis du ikke har en farvningsbakke, kan diaset placeres direkte oven på en isterningebakke af plast

Del 2 af 3: Udførelse af Gram Stain

Gramfarvning Trin 6
Gramfarvning Trin 6

Trin 1. Oversvøm udstrygningen med krystalviolet

Brug en pipette til at oversvømme bakterieprøven med flere dråber krystalviolet farvestof, undertiden kaldet gentianviolet. Vent tredive til tres sekunder. Krystalviolet (CV) dissocierer i vandige opløsninger til CV+ og chlorid (Cl–) ioner. Disse ioner trænger gennem cellevæggen og cellemembranen af både gram-positive og gram-negative celler. CV+ -ionen interagerer med negativt ladede komponenter i bakterieceller for at plette cellerne lilla.

Mange laboratorier bruger "Huckers" krystalviolet, som tilføjer ammoniumoxalat for at forhindre nedbør

Gramfarvning Trin 7
Gramfarvning Trin 7

Trin 2. Skyl krystalviolet forsigtigt af

Vip objektglasset, og brug en vaskeflaske til at sprøjte en lille strøm destilleret eller postevand ud over toppen af objektglasset. Vandet skal løbe ned over overfladen af udstrygningen, men ikke være rettet direkte mod det. Skyl ikke for meget, hvilket kan fjerne pletten fra grampositive bakterier.

Gramfarvning Trin 8
Gramfarvning Trin 8

Trin 3. Oversvøm udtværingen med jod, og skyl derefter

Brug en pipette til at dække udstrygningen med jod. Lad det sidde i mindst 60 sekunder, og skyl derefter af med den samme omhyggelige metode. Jod, i form af negativt ladede ioner, interagerer med CV+ for at danne store komplekser af krystalviolet og jod (CV – I -komplekser) i cellens indre og ydre lag. Dette vil fange den lilla krystalviolette farve i cellen, uanset hvor den har farvet.

Jod er ætsende. Undgå indånding, indtagelse eller hudkontakt

Gramfarvning Trin 9
Gramfarvning Trin 9

Trin 4. Tilsæt et affarvningsmiddel, og skyl derefter hurtigt

En 1: 1 blanding af acetone og ethanol bruges typisk til dette kritiske trin, som skal times omhyggeligt. Hold objektglasset skråt, og tilføj derefter affarvningsmidlet, indtil der ikke er mere violet farve synlig i afløbets afløb. Dette tager typisk under 10 sekunder eller endda kortere tid, hvis affarvningsmidlet indeholder højere koncentrationer af acetone. Stop øjeblikkeligt, ellers fjerner misfarvningen den krystalviolette plet fra både gram-positive og negative celler, og pletten skal gentages. Skyl straks overskydende affarvningsmiddel af med den tidligere teknik.

  • Ren (95%+) acetone kan bruges i stedet. Jo mere acetone der er, desto hurtigere virker affarvningsmidlet, hvilket kræver mere præcis timing.
  • Hvis du har problemer med at timing dette trin, kan du overveje at tilføje affarvemaskinen dråbevis.
Gramfarvning trin 10
Gramfarvning trin 10

Trin 5. Oversvøm udtværingen med modfarvning, og skyl derefter

En modfarvning, typisk safranin eller fuchsin, bruges til at tilføje ekstra kontrast mellem gramnegative og gram-positive bakterier ved at farve misfarvede (gramnegative) bakterier lyserøde eller røde. Lad det være tændt i mindst 45 sekunder, og skyl derefter af.

Fuchsin vil plette mange gram-negative bakterier mere intensivt, såsom haemophilus spp og legionella spp. Dette kan gøre det til en bedre mulighed for begyndere

Gramfarvning trin 11
Gramfarvning trin 11

Trin 6. Tør objektglasset

Du kan lade objektglasset lufttørre eller tørre det ved hjælp af papir, der sælges til dette formål. Gram -pletten er komplet.

Del 3 af 3: Undersøgelse af resultatet

Gramfarvning trin 12
Gramfarvning trin 12

Trin 1. Forbered lysmikroskopet

Placer diaset under lysmikroskopet. Bakterier varierer meget i størrelse, så den samlede forstørrelse, der kræves, varierer fra 400x til 1000x. I den højere ende af disse forstørrelser anbefales en objektiv med nedsænkning af olie til større klarhed. Læg en dråbe nedsænkningsolie på objektglasset, undgå bevægelse under påføring for at forhindre bobler. Flyt mikroskoptårnet, så objektivet klikker på plads og rører ved olien.

Nedsænkning af olie kan kun bruges på specialdesignede linser, ikke en "tør" linse

Gramfarvning Trin 13
Gramfarvning Trin 13

Trin 2. Identificer gram-positive og gram-negative bakterier

Undersøg diaset under lysmikroskopet. Gram-positive bakterier fremstår lilla på grund af den krystalviolette fanget i deres tykke cellevægge. Gram-negative bakterier fremstår lyserøde eller røde, da den violette skyllede gennem de tynde cellevægge, så kom den lyserøde modfarvning ind i dem.

  • Hvis prøven er for tyk, kan du se falske positive resultater. Plet en ny prøve, hvis alle bakterietyper er gram-positive, for at sikre, at resultatet er korrekt.
  • Hvis affarvningsmaskinen kørte for længe, kan du se falske negative resultater. Plet en ny prøve, hvis alle bakterietyper er gram-negative, for at kontrollere dine resultater igen.
Gramfarvning Trin 14
Gramfarvning Trin 14

Trin 3. Slå referencebilleder op

Hvis du ikke er sikker på, hvad en bakterie er, skal du kigge igennem en samling referencebilleder sorteret efter form og resultat af grampletten. Du kan finde databaser online på National Microbial Pathogen Database og mange andre websteder. For at gøre det lettere at identificere er almindelige eller diagnostisk vigtige eksempler sorteret nedenfor efter gramstatus og form.

Gramfarvning Trin 15
Gramfarvning Trin 15

Trin 4. Identificer gram-positive bakterier efter form

Bakterier klassificeres yderligere efter deres form under mikroskopet, oftest som kokker (sfæriske) eller stænger (cylindriske). Her er et par almindelige gram-positive (lilla-farvede) bakterier organiseret efter form:

  • Gram-positive cocci er generelt enten stafylokokker (hvilket betyder kokker i klynger) eller streptokokker (hvilket betyder kokker i kæder).
  • Gram-positive stænger omfatter Bacillus, Clostridium, Corynebacterium og Listeria. Actinomyces spp. stænger har ofte grene eller filamenter.
Gramfarvning Trin 16
Gramfarvning Trin 16

Trin 5. Identificer gram-negative bakterier

Gram-negative (lyserøde) bakterier er ofte klassificeret i tre grupper. Cocci er sfæriske bakterier, stænger er lange, tynde bakterier, og coccoidstænger er et sted imellem.

  • Gram-negative kokker er mest almindeligt Neisseria spp.
  • Gram-negative stænger omfatter E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas og mange andre. Vibrio cholerae kan forekomme som almindelige stænger eller buede stænger.
  • Gram-negative "coccoid" stænger (eller "coccobacilli") omfatter Bordetella, Brucella, Haemophilus og Pasteurella.
Gramfarvning trin 17
Gramfarvning trin 17

Trin 6. Evaluer blandede resultater

Nogle bakterier er vanskelige at plette præcist på grund af skrøbeligheden eller voksigheden af deres cellevægge. De kan have en blanding af lilla eller lyserøde pletter i den samme celle eller blandt forskellige celler i det samme udstrygning. Enhver bakterieprøve over 24 timer gammel kan have dette problem, men nogle arter er vanskelige at plette i enhver alder. De kan kræve mere specialiserede tests for at indsnævre identifikationen, såsom en syrehurtig plet, kulturvækstobservation, TSI-mediumkulturer eller genetisk testning.

  • Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium og Propionibacterium spp. betragtes alle som grampositive bakterier, men forekommer ofte inkonsekvent farvede.
  • Små og slanke bakterier som Treponema, Chlamydia og Rickettsia spp. er svære at gramfarve ordentligt.
Gramfarvning Trin 18
Gramfarvning Trin 18

Trin 7. Bortskaf materialer

Affaldsprocedurer varierer mellem laboratorier og afhængigt af de anvendte materialer. Typisk bortskaffes væsken i farvningsbakken i forseglede flasker som farligt affald. Blødgør dias i en 10% blegemiddelopløsning, og smid dem derefter i skarpe beholdere.

Tips

  • Husk, at udbyttet på Gram -farvning kun er lige så godt som prøven. Det er vigtigt at lære patienterne at levere gode prøver (f.eks. Forskellen mellem en spyt versus en dyb hoste for sputumprøver).
  • Som affarvningsmiddel virker ethanol langsommere end acetone.
  • Følg standard laboratorieforholdsregler.
  • Brug en kindpind til øvelse, da prøven skal indeholde både gram-positive og gram-negative bakterier. Hvis du kun ser en eller anden type, bruger du sandsynligvis for lidt eller for meget affarvningsmiddel.
  • Du kan bruge en fjedertøjstøj i træ til at gribe dias.

Advarsler

  • Acetone og ethanol er brandfarlige. Acetone fjerner olier fra dine hænder, hvilket får din hud til at absorbere andre kemikalier lettere. Brug handsker og brug med forsigtighed.
  • Lad ikke udtværingen blive tør, før du skyller pletten af eller modfarver.

Anbefalede: